T細胞來源確認：
外周血單個核細胞（PBMC）需新鮮分離（采血后6小時內處理），活細胞率≥95%；
冷凍保存的T細胞復蘇后，需經流式細胞術檢測CD3+細胞比例（目標值≥85%）。
無菌操作規范：
實驗全程在生物安全柜內進行，臺面用75%乙醇消毒，紫外照射30分鐘；
操作人員穿戴無菌手套、口罩，避免交叉污染。
T細胞激活試劑盒的操作流程
（一）激活體系配制
抗體包被步驟：
用PBS稀釋CD3抗體至5μg/ml，每孔加入50μl，4℃包被過夜或37℃孵育2小時；
棄去包被液，用PBS洗滌3次，去除未結合抗體（每次洗滌后離心5分鐘，200g）。
細胞重懸與刺激：
將T細胞調整至1×10?cells/ml，加入含10%FBS的RPMI1640培養基；
每孔加入100μl細胞懸液，再添加CD28抗體（終濃度1μg/ml）及IL-2（50U/ml），37℃培養。
（二）培養與監測
培養條件控制：
每24小時觀察細胞形態（正常激活細胞呈圓形或短梭形，聚集成簇）；
每3天半量換液（棄去50%上清，補充新鮮培養基），維持IL-2濃度。
活性與增殖檢測：
MTT法：培養第5天每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），4小時后溶解甲瓚，測定OD???值；
流式細胞術：標記CD25、CD69等激活標志物，評估激活效率（目標激活率≥80%）。
（三）終止培養與下游應用
細胞收獲：
離心收集細胞（300g，5分鐘），用PBS洗滌2次，去除殘留抗體；
用于CAR-T制備時，需確保細胞活率≥90%，細胞濃度1×10?cells/ml。
數據記錄：
記錄細胞形態、增殖曲線、激活標志物表達等數據，繪制趨勢圖；
異常結果（如激活率＜60%）需分析原因（如抗體濃度不足、污染等）。
更新時間：2025-07-01
點擊次數：172
當前位置：
上一個：
返回列表
