一、儲存條件
溫度范圍
T4 DNA聚合酶需在-20℃至-15℃的低溫條件下保存，部分產品在-20℃環境下可穩定保存2-3年。儲存液成分通常包含磷酸鉀緩沖液、EDTA、DTT及甘油，以維持酶活性并防止反復凍融導致的降解。
操作規范
避免反復凍融：建議分裝后保存，每次取用僅解凍所需量。
運輸與臨時存放：若需短期運輸或臨時存放，可使用干冰或-80℃超低溫冰箱，并盡量縮短暴露于室溫的時間。
二、熱失活參數
標準失活條件
T4 DNA聚合酶可通過75℃加熱10-20分鐘實現失活。
應用場景
終止反應：在DNA平末端制備或標記反應后，需通過熱失活終止酶活性，防止過度消化。
兼容性：失活后的酶不會干擾下游實驗，但需確保失活條件不破壞DNA模板或產物。
三、反應體系優化
核心反應條件
溫度與時間：
平末端制備：12℃反應15分鐘，利用3'→5'外切酶活性修飾DNA末端。
高保真合成：37℃反應5分鐘，按終濃度1 U/μl加入酶，確保高效摻入脫氧核糖核苷酸。
熱調節SLIC克隆：針對短同源片段，50℃處理30秒可提高克隆效率，通過高溫破壞DNA二級結構，增強酶與模板的結合。
緩沖液組成：
隨酶提供的10×反應緩沖液可優化酶活性。需避免緩沖液污染或ATP降解，必要時補充新鮮ATP。
酶用量調整
標準用量：1μL 10×緩沖液+1μL T4 DNA聚合酶用于1μg DNA的10μL反應體系。
靈活調整：
NGS文庫構建：按終濃度1 U/μl加入酶。
低效率反應：可適當增加酶量，但需避免過量導致非特異性結合或產物降解。
DNA底物質量
純度要求：通過瓊脂糖凝膠電泳或磁珠法純化DNA，去除蛋白質、RNA等雜質，防止抑制酶活性。
末端狀態：
平末端：加入5%-10%PEG-8000提高局部DNA濃度，增強連接效率。
粘性末端：確保末端未被核酸外切酶降解，制備后盡快反應或-20℃保存。若懷疑損傷，可用Klenow片段補平。
pH與離子強度
最適pH：7.5-7.8，需定期檢查緩沖液pH值，必要時用酸或堿微調。
Mg²?濃度：緩沖液中通常含100 mM MgCl?，過高或過低均會影響酶活性，需嚴格按說明書配制。
反應體積與操作細節
體積優化：推薦10-20μL反應體系，避免體積過小導致成分不均。
操作規范：使用精密移液器，避免氣泡產生；酶切質粒與目的片段摩爾比建議為1:3或1:4，減少假陽性。
更新時間：2025-10-10
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