抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody-Drug Conjugate, ADC），其核心設(shè)計理念是利用抗體的靶向性，將高細(xì)胞毒性的小分子藥物（Payload）精準(zhǔn)遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，從而實現(xiàn)高效殺傷并降低全身毒副作用。然而，一款成功的ADC藥物，其療效絕非簡單的“抗體"加“毒素"，關(guān)鍵在于連接子（Linker）穩(wěn)定性和抗體能否被高效內(nèi)化（Internalization）并在胞內(nèi)被及時降解（Degradation）以釋放Payload。

 一、 為何內(nèi)化與降解檢測至關(guān)重要？

在ADC的作用機(jī)制中，內(nèi)化與降解是承上啟下的核心步驟：

1.  內(nèi)化（Internalization）：ADC與細(xì)胞膜表面的靶抗原結(jié)合后，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等途徑進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)體（Endosome）。
   
   

2.  降解（Degradation）：內(nèi)體逐漸酸化并成熟為溶酶體（Lysosome），在溶酶體內(nèi)豐富的蛋白酶和酸性環(huán)境下，抗體部分被降解，同時裂解型的連接子斷開，釋放出游離的有效載荷（Payload），進(jìn)而發(fā)揮殺傷作用。

 二、 核心檢測技術(shù)匯總

目前，針對內(nèi)化和降解的檢測技術(shù)多樣，可根據(jù)檢測原理和目的進(jìn)行分類應(yīng)用。

• 基于pH敏感染料的內(nèi)化效率檢測

       原理：pH敏感染料在中性pH環(huán)境下無熒光，一旦進(jìn)入酸性胞內(nèi)環(huán)境（pH<6），熒光強(qiáng)度顯著增加。將抗體標(biāo)記pH敏感型試劑后，其熒光強(qiáng)度與內(nèi)化程度直接相關(guān)。

       優(yōu)勢：背景信號極低，靈敏度高，特別適合高通量篩選（HTS）。

       應(yīng)用：96或384孔板形式的大規(guī)?？贵w庫初篩。

*信號出現(xiàn)在環(huán)境 pH 達(dá)到 pKa 之前。

即用型：

• 高敏感性：pH-sensitive IgG labeling reagents 試劑與目的一抗的Fc段快速、定量地結(jié)合，形成預(yù)復(fù)合物。該試劑上已共價連接了pH敏感型染料。無需對一抗進(jìn)行繁瑣的化學(xué)偶聯(lián)，即可實現(xiàn)幾乎任何來源的IgG一抗的標(biāo)記，極大拓寬了應(yīng)用范圍并節(jié)省了時間。
  
  

• 操作便捷：試劑與抗體孵育10-20分鐘→復(fù)合物與細(xì)胞孵育→流式檢測
  
  

• 低背景：未內(nèi)化的抗體不會發(fā)光，有效避免了膜表面結(jié)合抗體對內(nèi)部化信號的干擾。
  
  

染料：

抗體&蛋白通用：任何在賴氨酸殘基上含有伯胺基或半胱氨酸氨殘基上含有巰基的蛋白質(zhì)均可與染料進(jìn)行偶聯(lián)。

應(yīng)用廣泛：流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡、熒光成像系統(tǒng)和高通量篩選（HCS）

驗證數(shù)據(jù)：

綠色熒光	紅色熒光	深紅熒光

2、基于細(xì)胞殺傷的內(nèi)化效率檢測- DT3C重組蛋白

DT3C是一種重組表達(dá)的融合蛋白，與抗體Fc端高度親和，結(jié)合后的DT3C分子在抗體被內(nèi)吞時一同進(jìn)入細(xì)胞。DT3C釋放出具有毒性的DT，阻斷蛋白翻譯過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

通過MTT, WST-1, UA-Glo細(xì)胞活力檢測試劑盒(UA070103)等方法，檢測細(xì)胞活力或細(xì)胞死亡情況，從而評估抗體的內(nèi)化效率。

數(shù)據(jù)展示：

 3、降解與Payload釋放檢測技術(shù)

1）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）

原理：目前金標(biāo)準(zhǔn)方法。通過高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)，直接定量檢測細(xì)胞裂解液中釋放出的游離小分子Payload及其代謝產(chǎn)物的絕對含量。

優(yōu)勢：靈敏度（可達(dá)皮摩爾甚至飛摩爾級別），可同時進(jìn)行定性和定量分析，提供最直接的Payload釋放證據(jù)。

應(yīng)用：ADC藥效評估、連接子穩(wěn)定性測試、代謝動力學(xué)研究。

2）免疫印跡（Western Blot）與免疫沉淀（IP）

原理：利用針對抗體Fc段、獨(dú)特型（Idiotype）或Payload的特異性抗體，檢測細(xì)胞裂解液中ADC降解片段或釋放的Payload。

優(yōu)勢：可提供降解產(chǎn)物的分子量信息，特異性高。

劣勢：半定量，操作繁瑣，通量低。

3）報告基因法（Reporter Gene Assay）

原理：構(gòu)建一種工程細(xì)胞系，其Payload（如某種毒素）激活的細(xì)胞殺傷效應(yīng)與一種報告基因（如熒光素酶Luciferase）的活性呈負(fù)相關(guān)。Payload釋放越多，細(xì)胞活性越低，報告信號越弱。

優(yōu)勢：功能性地反映Payload的整體生物學(xué)效應(yīng)，通量高。

劣勢：是間接檢測，易受其他因素干擾。

相關(guān)產(chǎn)品推薦：

抗payload抗體

部分驗證數(shù)據(jù)：

報告基因檢測試劑盒

三、 技術(shù)整合與未來展望

在實際的ADC研發(fā)項目中，通常不會依賴單一技術(shù)，而是多種技術(shù)聯(lián)用，相互驗證。例如：

   初篩階段：使用pHrodo或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行高通量內(nèi)化篩選。

   機(jī)制驗證：采用共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)化路徑和溶酶體共定位。

    最終驗證：運(yùn)用LC-MS/MS金標(biāo)準(zhǔn)方法精確量化Payload的釋放量和動力學(xué)。

抗體的內(nèi)化與降解是ADC藥物發(fā)揮“精準(zhǔn)殺傷"效應(yīng)的命門所在。一套成熟、完善且不斷創(chuàng)新的內(nèi)化與降解檢測技術(shù)體系，如同為ADC研發(fā)人員裝上了“火眼金睛"，能夠穿透細(xì)胞膜，洞察內(nèi)部的運(yùn)作細(xì)節(jié)。通過對這些關(guān)鍵過程的深刻理解和精準(zhǔn)量化，研究者能夠更高效地篩選出最佳候選藥物，優(yōu)化連接子技術(shù)，最終加速開發(fā)出更安全、更有效的ADC療法，造福全球癌癥患者。